DNA編碼化合物庫篩選

DNA編碼化合物庫（DEL）篩選是一個親和篩選過程，與傳統方法相比，DEL篩選具有許多優點：1）可以篩選數以千億甚至萬億計的庫化合物；2）大大節省蛋白質/靶標的使用量；3）篩選周期和化合物驗證周期短；4）篩選成本更加低廉。

DNA編碼化合物庫篩選基本原理和如何發現功能性分子

DEL篩選使用非常高的靶標濃度（μM范圍）來驅動平衡向靶標-化合物復合體的形成（篩選結果中直接讀取的是靶標-化合物復合物的豐度），因此，在高靶標濃度的情況下，所需的化合物濃度可以變得非常低（每種化合物篩選前為10^5或更低的拷貝），在一個篩選板孔的數百微升體積內可以實現數千億到數萬億的化合物篩選。

由于DEL篩選的高效性，它允許同時篩選多個樣本，通過多個樣本（含有或不含參考化合物，不同形式的靶標等）的比較，從而判斷化合物的結合位點，這樣具有功能的化合物就容易被識別出來。請參考我們的案例分析了解詳細信息。

DEL篩選對靶標的要求（主要參數）

對于純化蛋白：

• 純度>90%; 需要說明蛋白有沒有多聚體形式

• 蛋白需要帶有以下標簽His, biotin, Strep, GST, FLAG and Fc （前三個為首選）

• 蛋白標簽不能影響蛋白的功能

• 蛋白的用量視蛋白分子量而定（對于50KD的蛋白，6組樣本的蛋白使用量約為1 mg）

對于細胞表面或細胞內靶標，請參考以下文獻中的要求：ACS Comb Sci. 2015 Dec 14;17(12):722-31;  J Am Chem Soc. 2019 Oct 30;141(43):17057-17061;  Nat Chem. 2021 Jan;13(1):77-88. 

如何針對多個DNA編碼化合物庫進行篩選

在成都先導，我們按照化合物庫分子類型、結構特征、化合物構建方式等進行分類混合，形成DNA編碼化合物庫的子集，然后對化合物庫子集進行篩選，從而實現篩選的高效性和靈活性。我們也提供更為靈活的、基于篩選策略的聚焦化合物庫子集或單庫篩選，以提供有價值的結構-活性信息。

DEL篩選與先導化合物發現流程

• 靶標活性確認與篩選條件研究

篩選條件研究包括對靶標活性的確認和篩選可行性的詳細評估，以確保DEL篩選成功進行，盡量減少假陽性發生的機會。在篩選條件可行性評估中，我們針對試驗中的緩沖液、ssDNA、去垢劑、參考化合物、靶標固定等進行詳細的考察，以保證靶標能夠重現其應有或類似的表現。這些仔細研究是為我們后續的篩選提供對靶標的了解和增加篩選中的過程把控。篩選條件實驗是篩選非常重要的環節，針對復雜情況的處理是建立在大量篩選實驗的基礎上的。

• DEL篩選流程

根據DEL的不同篩選流程各有差異，以下為經典多樣性化合物庫的篩選流程，特殊DEL的篩選請參照：共價DEL篩選流程、蛋白降解DEL篩選流程、分子片段DEL篩選流程。

如下圖所示，經典DEL篩選過程包括：1）靶標與化合物庫的孵育，2）通過靶標標簽固定靶標，3）洗脫未結合或結合弱的化合物，4）從靶標上解離富集的化合物，5）質檢化合物庫的回收率，6）重復1-5步（根據化合物庫的回收率決定重復的輪次），7）當化合物庫的富集倍數約等于10^8時，進入PCR擴增環節，8）DNA高通量測序，9）DNA序列分析，產生3維的化合物富集信息，10）根據化合物富集情況，選定需要重新合成的不含DNA標簽的化合物，11）驗證重新合成的小分子化合物，最終得到先導化合物。

在成都先導，DEL篩選是在KingFisher系統下半自動完成的，以保證篩選樣本之間的一致性、轉移蛋白是最小的死體積和過程的可追溯性。有關KingFisher上的DEL自動化篩選，請參考以下的文獻：Nat Protoc. 2016 Apr;11(4):764-80。

• DEL篩選中庫化合物的使用量

DEL篩選中庫化合物的使用量指每一個化合物在首輪篩選中的拷貝數。我們系統性地對DEL化合物的使用量做了研究，請參考我們的文章：SLAS Discov. 2020 Jun;25(5):523-529。

• PCR 和DNA 高通量測序

我公司的高通量測序主要使用Illumina測序平臺，目前擁有Hiseq2500 和 NovaSeq6000兩套測序儀。該測序平臺提供6中不同的測序通量，提供從115M到6400M reads的穩定高質量測序（Q30≥90%），以適應不同篩選樣本組合下的及時DNA測序（從篩選到測序再到數據分析的零時延）。我們對Illumina測序中的PCR方法進行優化，請參考我公司的專利（專利號201811151077.3）。

?DNA測序結果解析

測序數據解析是將篩選的結果以DNA序列的形式轉換為這些DNA標簽編碼的化合物的過程，其中包括所使用的分子骨架、反應砌塊和庫化學反應。PolyO是HitGen發明的專有苗頭化合物識別算法，是一種從高通量測序數據中識別富集特征（富集特征是指一組共享共同支架和/或構建塊的化合物，通常用立方視圖中的線表示）的靈敏方法。通過比較樣本進行分析，在根據化合物的不同作用機制，將其在Data Warrior文件中生成化合物與DNA序列數量、屬性等信息的文件，給項目團隊進行進一步分析。

對于每一個DEL篩選，我們需要遍歷有豐富的信號數百個甚至上千個3維Data Warrior文件。為了提高數據處理的速度，及時做出數據驅動的決策，我們構建了DELT數據分析自動化平臺，實現了數據的自動處理和報告。這個自動化系統能夠在DNA測序完成后，自動啟動，并能在大約一天內完成篩選結果的自動報告，共化學家進行進一步確認和選定化合物進行重合成。

• 苗頭化合物推薦（Hit Proposal）與合成

在Hit Proposal過程中，我們一般有以下幾點考慮：1）信號強度（序列計數、富集特征強度）、化學型多樣性、化合物物化性質、不同DNA編碼化合物庫間的結構關聯和作用機制（樣本間信號比較）。具有代表性的Hit Proposal工作流程如下圖所示。

成都先導擁有經驗豐富的化學團隊，他們參與過數百個項目的重合成，熟悉DNA編碼化合物合成的反應、具有在庫的試劑、擁有先進的設備和儀器，能夠在合成行業中發揮最佳的效能。通常，每種化合物5毫克，最多100種化合物，合成周期約為6周。我們針對活性化合物、化合物骨架等提供克級合成。 

• 生物物理、生物化學檢測用于化合物的驗證

• ASMS（親和篩選質譜分析）進行化合物富集驗證

由于DEL化合物庫的反應有可能沒有100%完成，而且DEL篩選極為靈敏，所以我們采用親和篩選質譜分析（ASMS）對富集的帶有DNA的化合物進行驗證，以進一步確證篩選中獲得的可能結合物，提高化合物的篩選后轉化率。這種方法通過模擬DEL合成過程，同時考慮了產物和副產物。我們也在探索不同類型的可切割連接體，它們在DEL合成過程中保持相同的條件，同時也避免了親和力選擇過程中DNA標簽的影響。

• DEL篩選結果（SSR分析）驅動的化合物優化

海量的DEL篩選信息是進一步探測目標口袋、提供復合優化方向的重要資源。結構-信號關系（SSR）分析是在同一化合物族的基礎上進行的，這意味著化合物所涉及的化學成分高度相似，序列計數陽性與生物活性相關，將為優化中的結構優化方向和實際選擇提供大量和快捷的信息。代表性結構-信號關系分析如下所示，從中可以看出其在進一步優化中的指向性。

結構-信號關系分析流程圖