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      1. 技術能力
      2. DNA編碼化合物庫應用

      DNA編碼化合物庫應用

      通過DNA編碼化合物庫篩選發現新穎高活性NAA50抑制劑

       (與美國輝瑞合作項目,細節請參考 ACS Med. Chem. Lett. 2020, 11, 1175?1184)


      • NAA50蛋白與功能

      蛋白質的N末端乙?;梢杂绊懫涫欠襁M入細胞核,也可以作為降解信號來控制蛋白質的細胞穩定性。Nα-末端乙酰轉移酶(NAA50)是Nα-末端乙酰轉移酶NAT蛋白家族的成員。

      它與NAA10和NAA15共存于NatE復合物中,并負責復合物的酶功能。NAA50也被發現是正常姐妹染色單體凝聚和染色體凝聚所必需的。因此,NAA50酶抑制劑可能在腫瘤適應癥中有治療應用。酶催化和蛋白質結構如下所示。

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      • 已知NAA50異質結和DNA編碼化合物庫篩選目標

      化合物1是通過研究NAA50的生化機制設計的,它是AcCoA因子、一個蛋白的四肽底物(MLGP)的復合物。盡管化合物1是一種有效的NAA50抑制劑,但由于其分子量大(配體效率(LE)= 0.13),該分子不是特別有效。此外,其高分子量(MW=1223)和高極性(tPSA=577和cLogP=?4.1)可能阻止細胞膜的易滲透性,因此僅能作為一種好的外工具化合物使用。

      DNA編碼化合物庫篩選是為了獲得活性更高、選擇性更好的NAA50抑制劑,并且具有更好的理化性質(降低分子量、tPSA,增加logD)。

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      • DNA編碼化合物庫篩選實驗設計

      在典型的DEL選擇方案中,我們設置了3個樣本(靶標本身,本案例為His標簽的NAA50蛋白;His標簽的NAA50蛋白加上飽和濃度下的抑制劑化合物1;空白對照)。然而,在NAA50的研究中,我們發現NAA50蛋白在催化過程中涉及構象的變化。通過上述樣品1和樣品2的選擇結果的比較,我們不能有效地識別抑制劑。因此,我們通過添加AcCoA和CoA來加入另外兩個樣品,尋找與過渡態結合的化合物。最后的篩選實驗設計如下:

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      • 代表性的篩選結果

      DNA編碼化合物庫篩選的結果通常以3維形式展示,其中每個軸表示相應的反應砌塊,氣泡大小表示每個化合物的DNA序列的數量。如果化合物與蛋白質有更多的結合(高親和力或慢解離速率),序列數量將呈現為更大的氣泡。從前四個樣品(空白樣品5最為扣減樣本,未顯示)可以看出,Apo-NAA50、Apo-NAA50+AcCoA、Apo-NAA50+CoA和Apo-NAA50+化合物1(也稱為Bi-subi)的富集模式不同,證明NAA50在催化過程中有構象變化。選擇與所有蛋白質階段結合并與化合物1競爭的化合物顯然將產生NAA50抑制劑。在本案例中,其中一個選定的化合物結構如下圖所示(DNA編碼化合物庫中為外消旋體混合物)。所選化合物DEL951-34-888-1668進行了重合成與驗證。 

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      • 化合物驗證與化合物-蛋白共晶 

      我們對所選化合物DEL951-34-888-1668的兩個異構體進行合成(4a和4b),并在CoA和AcCoA存在下進行了SPR親和力測定和生化分析。手性異構體4a被發現是一種非常有效的抑制劑,具有更低的分子量、配體效率(LE)和tPSA。輝瑞對該化合物進行蛋白-化合物共結晶,下圖為化合物4a和NAA50的共晶結構(pdb代碼:6WFN)。

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      DNA編碼化合物庫技術實現新穎BRD4蛋白降解劑的發現


      • DNA編碼化合物庫技術在蛋白降解劑發現上的優勢

      DNA編碼化合物庫實現是一種基于親和力的方法來識別與靶相互作用的化合物,這些化合物可能具有抑制或激動的功能或僅僅與蛋白質結合。DNA編碼化合物的結構與蛋白質水解靶向嵌合體(PROTAC)非常相似,如下圖所示。DEL化合物和PROTAC分子都需要兩個具有已知連接點的分子共價連接,這兩個連接點對結合的影響最小。 

      更重要的是,DNA編碼化合物庫篩選能夠識別感興趣的蛋白質(POI)和E3連接酶的親和力結合物,因此通過它們的組織分布差異,在創造更強的知識產權和探索新型E3連接酶的治療效益方面具有優勢。 

      在傳統的DNA編碼化合物庫篩選當中,目標是尋找化合物,篩選的直接讀數是DNA序列的絕對數(理想情況下是化合物的絕對數量)。原則上,當POI和E3連接酶都用在DNA編碼化合物篩選時,我們可以使用POI和/或E3連接酶作為對照來鑒定與這兩種蛋白質同時結合的化合物。

      • POI-化合物-E3連接酶復合體穩定性是蛋白降解劑優化的關鍵

      為了驗證上述理論,我們以JQ1為BRD4親和化合物,沙利度胺為CRBN結合化合物,用不同長度的連接體來測試是否能夠區分三元鍵合的穩定性。具體地,我們合成了六個PROTAC分子和dBET1(一個著名的BRD4降解劑,Biochem Biophys Res common。2018,497(1):410-415),并測量其IC50值(下圖)。從IC50值上,我們無法知道哪一個結合BRD4和CRBN形成更穩定的復合物。 

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      然后用基于FRET的三元復合物穩定性實驗對這6個PROTAC分子和dBET1進行了評價,它們在三元復合體穩定性實驗中表現不同。BRD4在MV4;11中的降解實驗也證實了這6個PROTAC分子的降解差異(見下圖)。

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      • DNA編碼化合物篩選信號與三元復合物穩定性正相關

      為了證實DEL篩選能夠區分復合物的穩定性,我們制備了6個相應的PROTAC-DNA共軛化合物(如圖),以觀察DEL篩選是否可以觀察到不同的回收率。在“共軛化合物回收實驗”中,將共軛化合物1~6匯集到我們的DNA編碼化合物庫中,進行DEL篩選,并比較相應的DNA序列計數,如圖所示(DEL篩選請參考“PROTAC DEL篩選方法”)。共軛化合物-4是公認的最佳降解分子,因為它有顯著更高的測序計數,這是對應的數量化合物結合到CRBN-BRD4復合物。該鏈接鏈的長度與dBET1中的最佳鏈接器長度一致。另外,從僅針對于CRBN和BRD4篩選的樣本中共軛化合物的回收實驗并不能預示哪個鏈長的共軛化合物具有最佳的鏈長。

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      PROTAC-DNA 共軛化合物

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      DNA編碼化合物庫篩選中共軛化合物的回收(CRBN,BRD4,CRBN+BRD4)

      • 通過DNA編碼蛋白降解化合物庫進行新穎BRD4蛋白降解劑的發現

      我們的DNA編碼蛋白降解化合物庫包括E3連接酶結合化合物和數量巨大的多樣性化合物結構以及不同長度的鏈長。下圖是PROTAC DEL的通式,其中沙利度胺靶向結合CRBN,R1、R2、R3分別是化合物庫的鏈和不同化合物的砌塊。


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      以CRBN為E3連接酶的DNA編碼蛋白降解庫結構

      • 蛋白降解庫的篩選和項目目標

      在這個DNA編碼的蛋白降解化合物庫中,沙利度胺為公認的CRBN結合化合物,在本案中針對CRBN的篩選樣本被忽略。具體實驗方案如下:

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      本項目的目的是獲得與BRD4和CRBN結合的新化合物,然后證明樣品2中具有強信號的PROTAC分子能更好地降解BRD4。


      • DNA編碼蛋白降解化合物庫篩選結果

      下圖中的樣品1和樣品2(未顯示空白樣品)之間比較了DEL化合物富集的選定R3的化合物。

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                                                                      樣本1                                                 樣本2 

      平面R3=348清楚地表明,這個平面上的許多化合物優先與兩種蛋白質結合(樣品2),而不僅僅是BRD4(樣品1)。同時,也有許多化合物與兩種樣品的結合強度相似。需要說明的是,所有用于BRD4結合的化合物結構都不同于JQ1或任何報道的BRD4結合物。為了比較二者的結構相似性,用Tarnimoto相似性來描述二者之間的差異。當Tarnimoto相似性大于0.8時,兩個分子被認為是相似的。選擇具有代表性的化合物,其tarnimoto相似性分數如圖,說明我們發現的化合物為全新結構。

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      根據我們的推測,在樣本2中氣泡較大(測序計數較高)的化合物比氣泡較小的化合物形成更穩定的復合物。為了證明這一點,我們在樣品2中選擇了4個具有不同序列計數(DNA序列計數為1198,15042,119,4459)的代表性化合物,用于非DNA合成和蛋白質降解評價(western blot)。這4種化合物分別命名為75-NX-1、78-NX-1、123-NX-1和127-NX-1。以dBET1為參照物,測序計數較高的化合物75-NX-1、78-NX-1在MV4;11細胞中觀察到非常相似的BRD4降解;而化合物123-NX-1幾乎沒有觀察到BRD4降解?;衔?27-NX-1也沒有顯示BRD4降解。

      在MV4;11(CCK-8)的抗增殖試驗中,對PROTAC化合物75-NX-1及其BRD4結合部分(57-NX-1,未顯示結構)進行了評價,結果表明,化合物75-NX-1的活性遠高于57-NX-1(化合物57-NX-1被發現是BRD4抑制劑)。

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      MV4;11細胞抗增殖實驗

      綜上所述,通過DNA編碼蛋白降解劑庫篩選是一種快速和有效發現穩定POI:化合物:E3連接酶復合物的方法。我們充分意識到,還有其他因素可能影響蛋白質降解,如蛋白降解劑的溶解度、透膜性、結合方式等,但毫無疑問,DEL篩選方法為三元復合物的形成(蛋白質降解劑優化的一個重要步驟)提供了非常有效的工具。 

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